【佳學(xué)基因靶向藥物基因檢測】使用噬菌體選擇肽的高通量測序鑒定癌癥特異性受體突變 EGFRvIII 的新型肽配體

神奇藥檢測基因兩萬有必要嗎——標(biāo)準(zhǔn)

與專家交流選擇如何有效的藥物治療知道《Sci Rep》在 2022 Dec 1;12(1):20725.發(fā)表了一篇題目為《使用噬菌體選擇肽的高通量測序鑒定癌癥特異性受體突變 EGFRvIII 的新型肽配體》腫瘤靶向藥物治療基因檢測臨床研究文章。該研究由Sourour Mansour, Indranil Adhya, Coralie Lebleu, Rama Dumpati, Ahmed Rehan, Santu Chall, Jingqi Dai, Gauthier Errasti, Thomas Delacroix, Raj Chakrabarti等完成。

癌細(xì)胞通常顯示出大量的某些細(xì)胞表面分子，例如腫瘤相關(guān)抗原或特異性受體，這些分子很少出現(xiàn)在正常組織中，代表了腫瘤診斷和治療的潛在目標(biāo)。 EGFRvIII 存在于許多人類惡性腫瘤中：卵巢癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，但從未在正常組織中發(fā)現(xiàn)過。 因此，突變受體是開發(fā)新的癌癥特異性配體的明顯選擇。 因此，篩選和鑒定特異性結(jié)合EGFRvIII受體的肽將有助于開發(fā)用于癌癥檢測和治療的新型探針。 為此，腫瘤靶向藥物研究團(tuán)隊(duì)使用 12 聚體噬菌體展示肽庫來獲得特異性結(jié)合 EGFRvIII 受體的肽。 考慮到最終目標(biāo)是在靶向藥物遞送系統(tǒng)中使用 EGFRvIII 特異性肽，佳學(xué)基因檢測提出的關(guān)鍵參數(shù)是靶向細(xì)胞的特異性。 構(gòu)象表位靶向是無正常組織毒性的特異性靶向的關(guān)鍵概念。 事實(shí)上，溶液中的 EGF 受體在未受刺激的條件下主要作為單體存在。 EGFR 激活過程包括多個(gè)步驟：配體誘導(dǎo)的構(gòu)象變化和 EGFR 二聚化導(dǎo)致酪氨酸殘基的反式磷酸化和自身磷酸化。 這允許暴露某些稱為構(gòu)象表位的表位。 EGFR 的激活通常是由配體的結(jié)合引起的。 然而，由于 EGFR 過表達(dá)，允許該表位暴露的條件優(yōu)先發(fā)生在腫瘤特異性條件下。

最常見的篩選策略包括使用純化的特異性靶標(biāo)，將其吸收到固相中，然后通過 ELISA 篩選結(jié)合。 使用這種方法，使用純化的重組蛋白選擇的肽可能無法進(jìn)入活細(xì)胞中的靶標(biāo)。 此外，由于成本和時(shí)間相關(guān)因素，測序通常只在最后一輪進(jìn)行，掩蓋了不同肽命中的分析和隨后的多輪富集。 為了最大限度地降低這種風(fēng)險(xiǎn)，腫瘤靶向藥物基因檢測基因解碼對 EGFRvIII 的細(xì)胞外活性形式采用了直接捕獲淘選，因此構(gòu)象表位也在溶液中瞬時(shí)顯示。 對于從洗脫的噬菌體中選擇肽，使用高通量測序來分析分離肽的豐度和多樣性，以及識別目標(biāo)結(jié)合肽基序。 因此，佳學(xué)基因靶向藥物研究團(tuán)隊(duì)能夠選擇與這種瞬時(shí)構(gòu)象結(jié)合的肽。 科學(xué) 家團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證實(shí)了在穩(wěn)定表達(dá) EGFRvIII 受體的完整和活細(xì)胞上使用噬菌體展示肽作為靶細(xì)胞的結(jié)合，這確保了更具體的靶標(biāo)和可以特異性結(jié)合表達(dá) EGFRvIII 受體的細(xì)胞的肽的分離。

在這項(xiàng)研究中，使用高通量測序分析根據(jù)多輪富集確定的熱門命中，從第三輪生物淘選中選擇了五種肽。 在細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)之前對選定的肽進(jìn)行了肽克隆和測序驗(yàn)證。 隨后，使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步測試了五種噬菌體展示的肽，以確認(rèn)它們與 EGFRvIII 細(xì)胞的特異性結(jié)合。 為了減少選擇用于結(jié)合確認(rèn)的每個(gè)噬菌體展示肽的非特異性結(jié)合，在與 EGFR WT 和 EGFRvIII 細(xì)胞孵育之前，將擴(kuò)增的噬菌體與吸收親本 HEK 細(xì)胞混合。 在這五種噬菌體展示的肽中，與 EGFR WT 和親本細(xì)胞相比，VLGREEWSTSYW 似乎顯示出與 EGFRvIII 細(xì)胞的特異性結(jié)合，這讓人相信噬菌體與其各自靶抗原的細(xì)胞表面暴露區(qū)域結(jié)合。 因此，選擇該肽進(jìn)行進(jìn)一步研究。 多序列比對顯示該序列與各種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中任何特征蛋白質(zhì)的序列沒有表現(xiàn)出同源性。 這一發(fā)現(xiàn)表明 VLGREEWSTSYW 是一種新型肽，可以模擬復(fù)雜的表位，這可以解釋為什么它不存在于任何數(shù)據(jù)庫中。

對接結(jié)果表明，鑒定出的肽靶向人類癌癥特異性 EGFRvIII。 EGFRvIII 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)通過同源建模進(jìn)行建模。 肽的二級結(jié)構(gòu)被預(yù)測并停靠在 EGFRvIII 的活性位點(diǎn)上。

通過這一靶向藥物基因檢測對藥物開發(fā)的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用過表達(dá) EGFRvIII 或 EGFR WT 的細(xì)胞時(shí)，與 FALGEA（這是迄今為止報(bào)道的唯一 EGFRvIII 選擇性肽）相比，VLGREEWSTSYW 肽對 EGFRvIII 細(xì)胞的選擇性優(yōu)于對 EGFR WT 細(xì)胞的選擇性。 流式細(xì)胞術(shù)和 MST 實(shí)驗(yàn)表明，盡管在溶液中結(jié)合較弱，但 VLGREEWSTSYW 在細(xì)胞表面結(jié)合實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更大的親和力，并證明兩種肽都與 EGFRvIII 結(jié)合，而它們在溶液中均不特異性結(jié)合 EGFR WT

腫瘤基因檢測及靶向藥物治療研究關(guān)鍵詞：

癌癥,特異性,表皮生長因子,酪氨酸激酶,受體,突變變體 III,EGFRvIII,噬菌體展示，新型肽配體

腫瘤靶向藥物基因檢測的臨床前研究結(jié)果

腫瘤靶向藥物的研究性發(fā)現(xiàn)在此報(bào)告了使用針對癌癥特異性表皮生長因子酪氨酸激酶受體突變變體 III (EGFRvIII) 的噬菌體展示的新型肽配體的選擇和表征。這種受體在幾種癌癥中表達(dá)：卵巢癌、乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，但在正常組織中不表達(dá)。針對 EGFRvIII 篩選了一個(gè) 12 聚體隨機(jī)肽文庫。噬菌體選擇的肽通過下一代測序 (NGS) 進(jìn)行高通量測序，并研究了它們的多樣性以鑒定預(yù)計(jì)與 EGFRvIII 具有最高親和力的高豐度克隆。對富集的肽進(jìn)行了表征，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了它們對表達(dá) EGFRvIII、EGFR 野生型 (EGFR WT) 或低內(nèi)源水平 EGFR WT 的穩(wěn)定細(xì)胞系的結(jié)合能力。合成了最佳候選肽 VLGREEWSTSYW，并在體外驗(yàn)證了其對 EGFRvIII 的結(jié)合特異性。此外，計(jì)算對接分析表明，所鑒定的肽選擇性地結(jié)合 EGFRvIII。因此，新型 VLGREEWSTSYW 肽是一種很有前途的 EGFRvIII 靶向劑，可用于未來的癌癥診斷和治療應(yīng)用。

腫瘤靶向藥物基因檢測研究的重要意義：

表皮生長因子 (EGF) 酪氨酸激酶受體突變變體 III (EGFRvIII)1 是為數(shù)不多的已知癌癥特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物之一。 與野生型 EGF 受體 (EGFR WT) 相比，突變受體在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中缺少氨基酸殘基 6-273，并且刪除這 268 個(gè)氨基酸會(huì)在氨基酸 5 和 2742 之間產(chǎn)生一個(gè)具有新甘氨酸殘基的連接位點(diǎn)。 EGFRvIII 不包含配體結(jié)合域并且具有組成型活性。

盡管 EGFRvIII 的激酶活性比配體激活的 EGFR WT 弱得多，但發(fā)現(xiàn)它足以賦予腫瘤生長優(yōu)勢。 EGFRvIII 存在于許多人類惡性腫瘤中，例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌和乳腺癌。 EGFRvIII 是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中最常見的 EGFR 突變，在 20-50% 的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)。 EGFR WT9 過表達(dá)腫瘤患者的患病率最高，EGFRvIII 被認(rèn)為發(fā)生在 EGFR WT11 擴(kuò)增后。 然而，與在大多數(shù)小鼠和人類健康細(xì)胞中表達(dá)的 EGFR WT 不同，EGFRvIII 從未在正常組織中被發(fā)現(xiàn)。 因此，EGFRvIII 可用作癌癥診斷和治療的靶點(diǎn)，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

腫瘤靶向配體如肽和抗體可以有效地幫助將某些細(xì)胞毒劑（生物或合成的）遞送至腫瘤細(xì)胞，從而提高治療效果，同時(shí)限制正常組織暴露于細(xì)胞毒劑。 治療方法包括使用非武裝單克隆抗體 (MAb) 放射性標(biāo)記的 MAb15、與免疫毒素偶聯(lián)的 MAb 或硼化樹枝狀聚合物。 EGFRvIII 特異的單鏈可變片段 (scFv) 被發(fā)現(xiàn)并整合到串聯(lián)抗體 (TandAb) 構(gòu)建體中。 選擇性識別腫瘤細(xì)胞的小肽 (< 5 kDa) 優(yōu)于 MAb (150 kDa)、TandAb (100 kDa) 和 scFvs (20–30 kDa)，因?yàn)樗鼈冇捎诔叽缧〉枚喽子诤铣珊托揎?，具?更高的細(xì)胞膜穿透力，并具有較低的免疫原性。 即使與抗體和片段相比，肽的結(jié)合親和力較低，但在開發(fā)腫瘤靶向遞送系統(tǒng)時(shí)，可以通過在納米結(jié)構(gòu)表面摻入多個(gè)肽拷貝來提高親合力。

關(guān)于腫瘤成像應(yīng)用，迄今為止，只有 12 種癌癥突變特異性示蹤劑獲得 FDA 批準(zhǔn)，沒有一種用于腦腫瘤。 肽示蹤劑優(yōu)于抗體示蹤劑，因?yàn)樗鼈兊拿庖咴缘颓页杀镜停ㄈ缟纤觯?，而且還因?yàn)樗鼈兛梢詮难汉头前薪M織中快速清除，注射到成像的時(shí)間更短，并且它們與更短的藥物相容 -活的同位素。 因此，需要開發(fā)與 EGFR WT 相比能夠以高特異性結(jié)合 EGFRvIII 的新肽，用于診斷、治療或治療應(yīng)用——作為使用放射性標(biāo)記或熒光團(tuán)標(biāo)記的顯像劑，用于肽-藥物偶聯(lián)物或靶向遞送系統(tǒng) .

現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了兩種用于靶向腫瘤細(xì)胞的EGFR的短肽。 FALGEA 肽被描述為結(jié)合 EGFR WT 和 EGFRvIII。 從 GE11 肽中發(fā)現(xiàn)的 YHWYGYTPENVI 肽已被證明可與 EGFR WT 結(jié)合，但其與 EGFRvIII 的潛在結(jié)合尚不清楚。

這一具體的腫瘤靶向藥物基因檢測的研究的目的是使用噬菌體展示鑒定與 EGFRvIII 結(jié)合的新型肽，這是一種廣泛用于開發(fā)肽配體的方法。 在我們的策略中，該過程涉及三輪親和力選擇和噬菌體擴(kuò)增的迭代，然后是高通量測序 (HTS)，以分析分離肽的豐度和多樣性。 篩選的噬菌體展示的肽與蛋白質(zhì)靶標(biāo) EGFRvIII 的結(jié)合在細(xì)胞上進(jìn)行了測試，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了表征。 僅合成潛在的命中以確認(rèn)它們的細(xì)胞結(jié)合，并通過微尺度熱泳 (MST) 和計(jì)算對接評估它們的結(jié)合親和力。

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